Перспективные исследования в области получения интерферонов

С развитием методов молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии повышаются требования качества к практически важным продуктам, получаемым в данных областях. Одним из примеров подобных тенденций является повышение чистоты фармакологических субстанций, полученных с использованием технологий «рекомбинантных ДНК». Это, в частности, относится к белку, лекарственные препараты которого существуют уже более 20-и лет, - человеческому рекомбинантному интерферону a-2b.

Наиболее выгодным экономически является использование штаммов- продуцентов, в которых уровень биосинтеза целевого белка составляет десятки процентов от суммарных клеточных полипептидов (в этих случаях, как правило, гетерологичный белок накапливается в бактериальной клетке в виде нерастворимых конгломератов - телец включения).

Создание подобных бактериальных штаммов-продуцентов возможно только при соблюдении ряда условий, один из которых - стабильность мРНК при экспрессии целевого гена. Основным фактором стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного рекомбинантного гена. При наличии редко встречающихся аминокислотных кодонов, в гене, клонированном в составе мультикопийного экспрессионного вектора, подобная генетическая конструкция будет нежизнеспособна, или же, уровень синтеза целевого белка будет крайне низким. Другим фактором неэффективной экспрессии гетерологичного гена может являться интерференция процесса транскрипции гена (особенно, с сильного бактериального или фагового промотора) с процессом репликации рекомбинантной плазмиды, что возможно даже при наличии теминатора транскрипции в 3’-концевой нетрансли- руемой области целевого гена.

Повышение требований к чистоте препаратов на основе рекомбинантных белков, выделяемых из бактериальных штаммов-продуцентов, потребовало развитие новых биохимических методов анализа белков. Появились такие анализы на чистоту, как анализ ВЭЖХ, тесты на остаточную ДНК и на остаточные белки штамма-хозяина и вектора. Тест на пирогенность постепенно вытесняется тестом на бактериальные эндотоксины (ЛАЛ-тест). Усложнение аналитического контроля привело к принципиальным изменениям технологий производства субстанции рекомбинантных белков, т.к. применение старых технологических путей являлось не удовлетворительным по качеству конечного продукта, или же, экономически невыгодным.

При суперсинтезегетерологичных белков в клетках E. coli (в таких количествах, что целевой белок начинает образовывать тельца включения), бактериальные клетки находятся в состоянии стресса. Во многих случаях бактериальная культура практически не растет после индукции синтеза целевого белка. Кроме того, в условиях стресса, накапливающиеся в тельцах включения белки могут иметь нежелательные модификации, начиная с неотщепленногоN- концевого метионина, и заканчивая ацетилированием или окислением некоторых аминокислотных остатков белка. Подобные модифицированные вариантымогут не отделяться от целевого белка при его очистке с помощью различных видов гидрофобной и ионообменной жидкостной хроматографий (не говоря уже про аффинную и гель-фильтрационную), так как при модификации изменение конформации белка не происходит, а изменение массы и заряда ничтожно мало по сравнению немодифицированной молекулой. Но при правильном подборе условий модифицированный белок можно детектировать ОФ-ВЭЖХ, а следовательно, при большом количестве таких молекул в препарате, он не удовлетворяет критериям необходимой чистоты. Было замечено, что количество и характер подобных примесей в препаратах рекомбинантных белков зависит от условий ферментации штамма-продуцента, а не только от использованной технологии выделения и очистки целевого продукта. Таким образом, процесс получения высокоочищенной субстанции рекомбинантного белка для ее дальнейшего практического использования при создании медицинских или ветеринарных препаратов представляет собой комплексную задачу, изменения одного из этапов которой, значительно влияет на остальные этапы. [9, 17, 23]

Биологические препараты

Биологические препараты - группа медицинских продуктов биологического происхождения, в том числе вакцины, препараты крови, аллергены, соматические клетки, ткани, рекомбинантные белки.  Смотреть...

Антибиотики

Большинство ученых подразумевает под антибиотиками не только антибактериальные вещества, образуемые микроорганизмами, но и соединения, обладающие антибактериальной активностью, выделенные из животных тканей и высших растений.  Смотреть...